血友病B基因治疗研究现状

前言

血友病是一类X染色体连锁的隐性遗传性出血性疾病，主要分为两大类：血友病A(也称为甲型血友病)和血友病B(也称为乙型血友病)，分别因凝血因子VIII (FVIII，Factor VIII)或凝血因子IX (FIX，Factor IX)基因突变导致凝血因子的缺乏而引起。血友病A在男性婴儿中的发病率为1/5000，血友病B为1/25000，血友病重症患者血浆相应凝血因子含量小于正常人的1%，会频繁发生自发性出血，如关节内出血、软组织血肿、腹腔出血和脑出血等，最终导致严重的关节病、慢性疼痛，显著影响患者生活质量与寿命。 

血友病是十分典型的单基因突变引起的罕见病，该病的一些特点使其成为基因治疗的理想模型：(1) FIX表达水平的少量提高即能显著改善临床症状，据报告凝血因子水平从1%提高至正常血浆水平的2%以上即可显著降低重症患者自发性出血的发生率；(2)凝血因子治疗的有效范围宽(正常血浆水平的1-100%均可)，不需对表达水平进行严格控制。而因FIX的cDNA长度短(约1.6kb)，便于病毒载体携带，所以血友病B的基因治疗走的更快。

血友病B基因治疗发展史

从实验室到临床，血友病B的基因疗法大概经历了30多年时间，这期间2个关键人物——Katherine.A.High博士和Amit Nathwani博士做出了卓越的贡献，可以说是他们俩你追我赶的研究工作促使血友病的基因治疗取得了长足发展。

Katherine A. High，Sparks Therapeutics公司的总裁和首席科学家，宾夕法尼亚大学儿科学名誉教授

Amit Nathwani 博士，英国伦敦大学学院血液学教授，凯瑟琳多曼迪(Katharinee Dormandy)血友病中心和血栓研究室主任

图1. 重要血友病B基因治疗临床研究时间线

血友病B基因治疗的早期临床研究

早在2000年，Katherine.A.High博士就和她在美国费城儿童医院(Children's Hospital of Philadelphia)的团队采用腺相关病毒(Adeno-associated virus，AAV)作为载体，尝试对重型血友病B患者进行基因治疗。当时出于安全性考虑，选择的靶器官是骨骼肌(如若发生严重不良反应，注射位点处的骨骼肌可被切除从而及时终止研究，以充分保证受试者的安全)。这首次的尝试发现骨骼肌能正确且持续地表达FIX(表达可超过10年)，但是分泌入血液中的FIX蛋白含量始终达不到治疗剂量(<1%)，无法有效控制患者的出血症状。

有了第一次的经验，第二次尝试他们把靶器官更改为FIX的原始表达器官——肝脏，这一次的试水也一路跌跌撞撞，治疗显示了一定的疗效，但也遭遇了各种各样的新问题。首先遇到的一个问题是在接受治疗的患者精液样本中检测到病毒载体的DNA，可能存在潜在的遗传毒性，随即研究被叫停。后续的研究发现，检测到的载体DNA来源于精液而非来自精子，并且载体DNA持续存在的时间较为短暂，一过性的持续大约9个月时间，研究被批准继续进行。随后在剂量增加试验，当病毒剂量增加到最高剂量时遇到第二个大问题，并且该问题对后续的基因治疗研究具有重要的参考意义。研究中，原本高剂量组患者在接受治疗2周后显示出良好的治疗效果，血浆FIX水平稳定增长至12%左右，患者临床出血症状也得到了有效的控制，但随后发现患者转氨酶开始升高(与肝脏损伤相关)，同时伴随FIX蛋白水平急剧下降，治疗后第5周患者转氨酶水平达到最高值，第12周时缓慢恢复正常水平，与此同时患者体内FIX水平也降至基线水平，疗效丧失。

这种FIX水平骤然下降、治疗效果不能维持的现象在模型动物上从未发现过，它的出现相当于给研究人员兜头浇了一盆冷水，也引起了大家的广泛关注和研究。根据后续的机制研究，人们推测FIX表达减少和肝脏毒性可能由T细胞介导的细胞毒反应引发。患者在接受治疗之前可能已感染过相应野生型的AAV病毒，从而体内有抗AAV的记忆T细胞，当再次接触治疗用AAV时产生大量对治疗用病毒特异的CD8+T细胞，导致病毒载体的感染效率降低；此外，当患者的肝细胞被AAV感染后，将病毒的衣壳蛋白递呈于肝细胞表面，T细胞识别这些抗原后最终可特异性地将被AAV感染的肝细胞清除，从而导致FIX蛋白表达骤减，治疗效果不能维持。目前，所有接受AAV基因治疗的患者在治疗后都会产生对病毒衣壳特异的免疫反应，并产生高滴度的抗体，这一现象限制了同类型AAV基因治疗的重复进行。这个过程是基因治疗研究中一个很有潜力的研究方向，毕竟治疗用的病毒载体和具有复制能力的野生病毒并不相同，这个过程究竟是如何引发，如何阻断或抑制这个过程都有待阐明。

血友病B基因治疗的“突破”

上述一系列的意外事件在临床前的小鼠，大鼠，兔，血友病犬和非人灵长类动物研究中都未曾出现过，再次说明了动物模型并不能完全反应人体试验情况，即使有了充分的临床前研究，每次的临床研究仍然像是驶向星辰大海的一叶扁舟，充满了各种不确定性，最终的成功似乎需要那么一点点运气的成分。血友病B基因治疗的这一点点的“运气”在这一路荆棘之后最终降临了。

2009年，另一位风云人物——当时还在圣裘德儿童研究医院(St. Jude Children’s Research Hospital)工作的Amit Nathwani博士和同事发起了一项临床研究，这项研究首次在临床上实现了FIX的长期表达。该项研究与Katherine A. High博士的主要区别在于对AAV载体进行了大幅的改造，采用了FIX密码子优化的、自互补(self-complementary) AAV (scAAV2/8-LP1-hFIXco，LP1为肝脏特异性启动子)作为载体。相比之前研究采用的载体，scAAV2/8-LP1-hFIXco用双链、互补的DNA代替原本的单链DNA，因此AAV感染细胞后无需依赖宿主细胞将单链基因组转变为有转录活性的双链基因组，大幅增加了感染效率；除此之外还对目的基因FIX进行了密码子优化以增加表达量。目的蛋白FIX的表达水平是剂量依赖的，特别值得注意的是，该研究高剂量组患者也出现了转氨酶升高的情况，在监测到转氨酶(转氨酶升高被认为与肝脏损伤或炎症相关)升高后立即对患者进行了激素治疗，采用短期的类固醇——氢化波尼松来减少炎症反应，最终患者的转氨酶水平在5天内恢复正常。该研究先期披露的结果显示，scAAV2/8-LP1-hFIXco增加了患者体内FIX水平，并在4个月内达到稳定水平(正常水平的1-6%之间)，治疗效果可稳定维持6年以上，目前这些患者仍在随访中。患者的FIX水平与治疗剂量相关，高剂量组 (2×1012 vg/kg) 6名患者的FIX水平均有升高，FIX平均值达到5.1±1.7%，患者的出血事件发生率及相应用药减少了90%以上。同时，该项研究显示了血友病B基因治疗应用AAV8载体的一些优势，相较之前用的主要载体AAV2，AAV8在的人群中的感染率较低具有更强的嗜肝性。这是一项里程碑式的研究，成功证明AAV作为载体的基因治疗能在人体中维持较长时间地相对稳定地FIX表达，并实现患者表型由重型到轻型的转换。

血友病B基因治疗的“飞跃”

High博士发起的临床研究中，低剂量组患者虽然没有达到治疗效果，但是同时也没有出现肝脏损伤的迹象，提示载体的剂量和载体介导的免疫反应关系密切；High博士所在的Spark公司在随后的研究中把重点放在了降低治疗用AAV载体剂量方面，同时结合Nathwani博士研究取得阶段性成功的研究经验，High博士团队对目的基因FIX进行了优化。他们采用FIX高活性变体(FIX-Padua，其FIX的338位碱基从精氨酸变为亮氨酸，相比于野生型FIX活性增加5-10倍)作为目的基因，试图通过增加FIX活性提高基因治疗效果。Spark Therapeutics公司在2017年的止血与血栓研究学会(HTRS，Hemostasis and Thrombosis Research Society)科学讨论会上对该项研究进展做了报告。参与该项研究的10名重型患者在接受载体治疗后(剂量为5 x 1011 vg/kg)，出血事件减少了96%、治疗用药减少了99%，其中9名患者无需再注射FIX制品控制出血。治疗12周后患者体内FIX活性水平仍可稳定维持在14-81%，平均值为33%，比先前的研究有了大幅的提高。值得注意的是，研究中并未发现严重的安全风险，未见大家普遍关注的FIX抑制物生成且无血栓事件发生，但有2名患者出现了无症状的转氨酶瞬时升高及FIX活性降低的情况，在接受口服皮质类激素治疗后，患者转氨酶水平回归正常值，FIX活性维持稳定水平，其中1位患者FIX活性最终稳定在15%左右，而另一位患者维持在70-80%之间，并维持超过9周的时间。这个治疗方案已于2016年7月获得美国FDA的突破性疗法认定，这是血友病B基因治疗的又一个爆炸性进展，让我们看到了血友病B治愈的巨大希望。

小结

基因治疗是最有可能治愈血友病的疗法，近些年来血友病B的基因治疗领域已取得了非常令人振奋的结果，更有乐观的估计在未来5年内血友病B的基因疗法可能面市，真正走到患者中去。同时，血友病基因治疗发展过程中遇到的这些磕磕绊绊也给我们带来许多思考和提示：

不同临床研究的结果差别巨大，是什么原因导致有些治疗效果可以长期维持而有些不能呢？比如，在High博士取得飞跃性成果的研究之前，Baxalta公司同样发起过一项FIX-Padua为目的基因的治疗性研究，不过这项研究没有取得同样的成功，接受治疗的患者体内FIX表达水平增加仅能维持8-10周。到底是什么因素导致了不同试验之间天差地别的结果呢？

1.病毒载体，目前来看可能是试验成功与否最大的影响因素

• AAV载体有多种血清型，不同血清型有各自亲睐的靶细胞，并且不同血清型AAV在人群中的携带程度也不同，这可能影响治疗效果；

• AAV病毒载体的大量生产目前还较为困难，同时AAV病毒载体的空载率等质量因素也可能影响治疗效果；

• AAV病毒载体是否有相应的优化。

2.目的基因

• hFIX基因有一系列高凝血活性突变体，利用高活性突变体进行治疗可提升目的蛋白的表达量，如采用FIX-Padua做为目的基因；

• 目的基因是否经过密码子优化。

3.病毒衣壳免疫

• 如何避免和降低患者中发生病毒衣壳免疫，目前还没有明确的方法；

• 对于发生病毒衣壳免疫的患者，使用皮质类激素的耐受性良好，或可控制衣壳免疫反应。

新的展望

上述通过AAV作为载体向靶细胞中导入正常人FIX基因进行基因治疗的方法，导入的目的基因并不或者很少整合进入靶细胞的基因组，那么问题就来了，随着细胞的更新，游离形式存在的目的基因会逐渐减少，最终导致目的蛋白的表达随着时间而减少；而且因新生儿细胞的分裂增殖速度较快，这类方法无法用于患病新生儿的治疗。由此虽然这类基因治疗方式降低了致癌性和致突变性，且现有结果表明目的蛋白的表达可持续超过7年时间，但仍然存在一定的局限。

近些年来，随着基因编辑技术的发展，将目的基因安全有效的整合到患者的基因组中已逐渐变得并不那么难以实现。在血友病治疗领域，已有临床研究试图通过锌酯酶介导的基因组编辑直接向患者自身肝细胞的白蛋白位点导入无启动子的FIX基因，利用高活性的白蛋白启动子实现FIX的安全、高效表达(白蛋白为肝脏高表达内源基因，普遍被认为是安全位点)。该研究虽并非是对异常FIX基因进行直接替换，但也是首次试图在人体中进行FIX基因的定点整合。在相关的临床前研究中，研究人员在小鼠模型检测了锌指酶在体内的基因纠正情况，相关结果显示锌指酶在宿主DNA上实现了双链剪切，通过同源重组修复了异常基因，并在小鼠模型实现人FIX的表达，其平均活性水平为正常血浆的23%。该种方法需要患者同时感染两种AAV病毒载体，一种携带锌指酶，一种携带FIX的cDNA，但这种通过基因编辑导入目的基因的方法可能存在脱靶效应，造成非特异性剪切，具有一定的安全风险。

除锌指酶技术以外，也可以利用TALEN和CRISPR / CAS9技术进行定点的整合，特别是今年来发展迅猛的CRISPR / CAS9技术。但这类利用内切酶增加重组效率的定点整合技术都存在一定的脱靶风险，是这类基因编辑疗法所面临的最主要安全问题。脱靶效应不仅与使用的内切酶类别相关，也与内切酶的表达时间和表达水平相关。例如，如利用CRISPR / CAS9技术定点整合FIX基因，我们更希望内切酶CAS9是瞬时表达而非永久表达。

其实，人们可能更希望对基因“哪里坏了修哪里”，实现对患者FIX基因中突变的位点的原位修复，原位修复可能是我们对血友病B基因治疗未来最美的期待。但就目前条件而言离实现还较为遥远，因为与地中海贫血或进行性肌营养不良等疾病所不同，血友病B基因发生突变的区域和突变类型相对分散，没法通过几种简单的策略实现对所有突变类型的纠正，缺乏通用性，期望技术发展能出现快速的特异性的基因疗法。

参考文献

1.High, K.A., Gene therapy forhemophilia: the clot thickens. Hum Gene Ther, 2014. 25(11): p. 915-22.

2.Nathwani, A.C., A.M. Davidoff, and E.G.D.Tuddenham, Advances in Gene Therapy for Hemophilia. Human Gene Therapy, 2017.28(11): p. 1004-1012.

3.严红,任兆瑞,曾溢滔. 血友病B基因治疗研究进展.《中国医药生物技术》, 2017,12 (4).

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